No se puede considerar a la hibridación in situ como una técnica de uso general. Sin embargo, aporta una información sobre la fisiología de las células y los tejidos que no es posible obtener con otras técnicas. La hibridación in situ se usa ampliamente en investigación en desarrollo embrionario, diferenciación de células madre, manipulaciones genéticas o cambios en la fisiología celular frente a señales externas, entre otras. Permite descubrir la expresión de un gen mediante la detección de su producto, el ARN mensajero. Podemos descubrir qué células expresan un gen determinado y cuándo lo expresan. La expresión génica es un testimonio directo de la funcionalidad celular. Existe otra aplicación de la hibridación y consiste en la localización física de un gen sobre un cromosoma.

La hibridación in situ se basa en la complementariedad de bases de nucleótidos. Del mismo modo que en la inumocitoquímica se usan los anticuerpos, en la hibridación in situ se usa una secuencia de nucleótidos, denominada sonda, que es complementaria a la secuencia del ARN mensajero que queremos detectar y que está marcada con una molécula que luego pondremos de manifiesto.

Quizá una de las razones por las que la hibridación in situ no es común todavía en los laboratorios de histología es porque sintetizar una sonda es complicado y generalmente no se puede usar en una especie animal o vegetal distinta para la que se ha producido dicha sonda. Ello es porque un mismo gen (ARN mensajero), por ejemplo un mismo receptor de membrana, de distintas especies tienen secuencias que no son idénticas y por tanto impiden la hibridación de sondas que no sean específicas. Sin embargo, una vez obtenida la sonda el proceso es sencillo.

Para obtener una sonda hay primero que clonar la secuencia de bases del gen (ARN mensajero) que queremos detectar. Clonarl implica realizar una serie de pasos: 1) Una vez purificado el ARN de nuestro tejido, los ARN mensajeros se retrotranscriben (transcripción inversa), es decir, se hacen copias complementarias de ADN de todos los fragmentos de ARN mensajero. Se obtienen hebras de ADN denominadas cDNA. 2) Mediante la técnica de PCR ("polymerase chain reaction") se consiguen multitud de copias de manera específica de la secuencia de ARN mensajero que queremos estudiar. 3) Dichas copias se integran en un plásmido y posteriormente se introduce en bacterias. 4) Se cultivan las bacterias para que proliferen y así también conseguir gran cantidad de plásmidos, que se duplican en cada división bacteriana. 5) Los plásmidos se extraen y purifican. 6) Mediante un proceso de transcripción similar al que ocurre en el núcleo de las células, a partir de estos plásmidos se consiguen numerosas réplicas complementarias a nuestra secuencia inserta, que será también complementaria a la secuencia del ARN mensajero que queremos detectar. El resultado de la transcripción realizada repetidas veces es un gran número de cadenas de ARN denominadas sondas. Durante su síntesis es cuando se añaden los nucleótidos conjugados con las moléculas marcadoras que nos servirán para detectarla una vez la hibridación se haya producido. Normalmente son moléculas pequeñas como la digoxigenina y la biotina, aunque también se pueden utilizar moléculas fluorescentes, que se une a los nucleótidos que formarán parte de la sonda.

Esquema resumido del proceso de hibridación in situ. NBT (nitro blue tetrazolium) y el BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato, sal de toluidina) son los sustratos de la fosfatasa alcalina.

Imagen que muestra neuronas (de color azul) que expresan el receptor D1 para la dopamina en el cerebro basal de una lamprea.

Esquema del proceso de hibridación in situ sobre secciones de criostato.

La hibridación in situ se puede combinar con otras técnicas como la inmunocitoquímica o tinciones generales.